RECK及MMP2在骨肉瘤組織中的表達及意義論文

【摘要】 檢測reck蛋白及明膠類基質金屬蛋白酶2（mmp2）在骨肉瘤組織表達,探討其在骨肉瘤的發生、發展、浸潤和轉移中的作用。方法 選擇臨牀及病理資料完整的存檔骨肉瘤標本30例,另取骨軟骨瘤標本10例作爲對照。採用 pv6000免疫組化方法檢測reck及mmp2蛋白的表達。結果 reck在骨肉瘤組織中低表達(30.0%)，在骨軟骨瘤組織中高表達（80.0%）,兩者相比差異有顯著性（2=5.76,p<0.05）； mmp2在骨肉瘤組織中高表達(76.7%)，在骨軟骨瘤組織中低表達（10.0%）,兩者相比差異有顯著性(2=11.25,p<0.05)；骨肉瘤組織中reck與mmp2的表達呈負相關(r=－0.84,p<0.05)。結論 骨肉瘤組織中reck低表達,而mmp2高表達。reck及mmp2可能作爲預測骨肉瘤浸潤轉移的重要指標。

【關鍵詞】 骨肉瘤；reck；明膠酶a；免疫組織化學

［abstract］ objective to detect the expressions of reversion瞚nducing cysteine瞨ich protein with kazal motifs (reck) and matrix metalloproteinase2 (mmp2) in osteosarcoma, and explore their correlation with the occurrence, development, invasion, and metastasis of the tumor. methods pv6000 immunohistochemistry was used to measure the expressions of reck and mmp2 in 30 samples of osteosarcoma with complete clinicopathological data, and another 10 cases of osteochondroma served as a control. results the expression rate of reck in osteosarcoma was low (30.0%), and that in osteochondroma was high(80.0%), the difference between them being significant (2=5.76,p<0.05) expression of mmp2 in osteosarcoma was high (76.7%), and that in osteochondroma was low (10.0%), the difference between them was also significant (2=11.25,p<0.05). the expression of reck was negatively correlated with that of mmp2 in osteosarcoma(r=-0.84,p<0.05). conclusion in osteosarcoma, the expression of reck is low, and expression of mmp2 is high. reck and mmp2 may be served as important markers to predict the infiltration and metastasis of this malignancy.

［key words］ osteosarcoma; reversion瞚nducing cysteine瞨ich protein with kazal motifs; gelatinase a; immunohistoche瞞istry

骨肉瘤(os)是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤，其惡性度高，易早期發生遠處轉移(尤其是肺轉移)，成爲病人死亡的主要原因。因此，探討os早期侵襲轉移機制具有重要的意義。reck基因是新近發現的抑癌基因。有研究表明,reck是透過負性調節基質金屬蛋白酶2(mmp2)、mmp9、膜型基質金屬蛋白酶1 (mt1瞞mp)來抑制腫瘤的侵襲和轉移[14]。本研究採用免疫組織化學方法分別檢測reck和mmp2蛋白在os組織中的表達情況,進一步闡明兩者在os發生、發展、浸潤和轉移中的分子機制,爲os的診斷和治療提供理論依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選用我院臨牀及病理資料完整的os標本30例及骨軟骨瘤標本10例,其中os組中男19例,女11例，年齡6.3～22.0歲，平均13.6歲；骨軟骨瘤組中男6例，女4例，年齡5.5～12.5歲，平均8.3歲。按enneking分期標準，30例os中ⅰ期8例，ⅱ期8例，ⅲ期14例。按病理類型劃分，骨母細胞型os者14例，軟骨母細胞型os者4例，纖維母細胞型os者3例，毛細血管擴張型os者4例，其他類型者5例。按腫瘤發生部位劃分，股骨14例，脛骨8例，其他部位8例。按有無肺轉移劃分，無肺轉移12例，有肺轉移18例。在獲得病理標本前，所有病人均未進行特殊治療。

1.2 儀器及試劑

濃縮型兔抗人reckmab試劑購於美國santa cruz公司,mmp2兔抗人mab購於武漢博士德生物製品有限公司,pv6000免疫組化試劑盒及dab顯色試劑盒購於北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學染色所需的'常規試劑及設備均由我院病理科提供。

1.3 標本的處理

所有標本均常規脫鈣，40 g/l的甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μm厚切片。採用pv6000 免疫組化方法檢測reck及mmp2蛋白在os組織及骨軟骨瘤組織的表達。一抗工作濃度:reck爲1∶100,mmp2爲1∶100。pbs緩衝液代替一抗作爲陰性對照，所有操作均按照說明書嚴格執行。

1.4 結果判定

reck及mmp2蛋白陽性信號均呈棕黃色顆粒狀，主要位於細胞質內。高倍鏡下觀察細胞，隨機選取5～10個視野（每個視野觀察細胞數不少於200個），按陽性細胞所佔百分比及着色深淺進行結果判定[5]。①按切片中細胞着色深淺評分：0分，細胞無顯色；1分，細胞顯色淺黃色；2分，細胞顯色棕黃色；3分，細胞顯色棕褐色。②按陽性細胞數佔同類細胞數的百分比評分：<30%爲1分，30%～70%爲2分，>70%爲3分，取①、②兩項評分的乘積作爲總積分，0～1分爲陰性（-），2～3分爲弱陽性（+），≥4分爲陽性（叮。

1.5 統計學處理

採用spss 15.0及ppms 1.5[6]統計軟件進行統計學處理，計數資料比較採用2檢驗，以p<0.05爲差異有顯著性。

2 結果

2.1 reck及mmp2在兩組中的表達情況

兩組間reck及mmp2表達陽性率比較差異有顯著性(2=5.76、11.25，p<0.05)。見表1。表1 兩種組織reck及mmp2表達情況（略）

2.2 reck及mmp2在os組中的表達及與臨牀病理特徵的關係

reck和mmp2在不同性別、不同病理類型及不同發生部位的os組織中的陽性表達率比較差異無顯著性(p>0.05)；reck和mmp2在與enneking外科分期及有無肺轉移的os組織中的陽性表達率比較差異有顯著性(2=5.56～11.29,p<0.05)。見表2。表2 reck及mmp2在骨肉瘤組織表達及與臨牀病理特徵的關係（略）

2.3 reck及mmp2的相關性分析

os組織中reck與mmp2的表達呈負相關(r=-0.84，p<0.05)。見表3。表3 reck及mmp2在os組織中表達的相關性（略）

3 討論

os是兒童和青少年最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，早期轉移（尤其是肺轉移）是影響病人治癒率提高的主要因素。因此，探討os的轉移機制和影響因素對治療本病及提高病人生存率具有重要的意義。本文分別檢測了reck及mmp2在os組織中的表達情況，以探討兩者在os發展及轉移中的意義。

基底膜和細胞外基質(ecm)是阻止腫瘤侵襲和轉移的主要屏障,腫瘤的侵襲和轉移首要條件就是應具備降解細胞外基質和基底膜的能力,這一過程涉及大量的蛋白酶及其抑制劑,其中基質金屬蛋白酶（mmps）家族是基底膜降解過程中必不可少的酶,幾乎能降解ecm中所有的成分和基底膜的膠原,促使腫瘤細胞侵襲周邊結締組織並進入脈管系統,最後到達其他組織器官。mmps是自然界進化中高度保守的一類酶, 由20多個鋅依賴性內肽酶組成，廣泛分佈於植物、脊椎動物、無脊椎動物中,分子大小各異,有一定的底物特異性，是影響腫瘤侵襲和轉移的關鍵酶。根據底物的不同,主要分爲以下幾類[7]:膠原酶、明膠酶、基質溶解素、膜型基質金屬蛋白酶及其他類型。有研究結果表明,mmps過度表達與腫瘤的惡性程度密切相關[78]。

reck基因是1998年發現的一種新基因,其在正常組織中高表達,而在各種腫瘤來源的細胞系及轉染了ras等癌基因的細胞中低表達[3,9]。此外基因敲除研究發現,reck基因還與血管生成密切相關,其適量表達能抑制血管的生成[1012]。目前研究結果表明,reck基因能在轉錄後水平抑制至少3種mmp，即mmp2、mmp9及mt1瞞mp,進而抑制腫瘤的血管形成及轉移[1012]。具體作用表現爲膜表面錨定的reck基因抑制mmp9前體的分泌,而錨定的reck蛋白及可溶性reck蛋白均可抑制mmp2、mmp9及mt1瞞mp的活性。

本實驗結果顯示,reck蛋白在os組織中的表達明顯低於在骨軟骨瘤組織中的表達，兩組間差異有顯著性；os組中存在肺轉移的組織reck表達率明顯低於無肺轉移的組織表達率，兩組間差異有顯著性,即reck在os組織中低表達,並隨腫瘤浸潤及遠處轉移的發生而降低，與kang等[13]報道的結果相符，提示reck基因表達的缺失與os的發生、發展、浸潤和轉移密切相關,而且可能爲判斷os惡性程度提供依據。mmp2在os組織中的表達明顯高於在骨軟骨瘤組織中的表達,兩組間差異有顯著性,其在os存在肺轉移的組織中表達率又明顯高於無肺轉移的組織表達率，兩組間差異有顯著性,即mmp2在os組織中高表達,並隨腫瘤浸潤及遠處轉移的發生而增高。

本實驗結果同時顯示，reck和mmp2在os組織中的表達呈負相關。mmp2的表達隨reck的降低而升高,提示os組織中reck表達的缺失導致了對mmp2的抑制作用降低,而使mmp2高表達,進而促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移。

總之,reck和mmp2的異常表達可能在os的發生、發展和浸潤轉移過程中起重要作用,有可能成爲判斷os生物學行爲的重要指標。但其具體機制和途徑目前尚不清楚,需要進行更深入的研究。

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