兼併引物PCR擴增效率提升研究論文
克隆非模式生物的基因,往往要先用到兼併引物。兼併引物(亦稱簡併引物,degenerate primer),是多種不同但有相關性的引物的混合物。利用基因或其編碼的蛋白質在進化上的相關性進行序列比對後,根據保守區域設計的引物,或者根據氨基酸序列設計的引物,一般會有一定的兼併度。利用兼併引物做PCR擴增時,由於兼併引物實際是多種引物的混合物,其中真正能和靶基因序列較好配對的只有少數幾種,因此降低了PCR擴增中的有效引物濃度,導致擴增效率下降;同時也會顯着提高其與非靶基因序列的配對,導致特異性下降,非靶基因擴增大量增加,當爲了提高兼併引物的濃度以提高PCR擴增效率時,這點尤爲明顯。目前,能夠改善兼併引物擴增的方法並不多,Knoth等用次黃嘌呤鹼基替代引物中的兼併鹼基,能夠提高擴增效率[1],Don等的降落PCR(touchdown PCR)能夠減少PCR的條件優化同時提高靶基因的擴增效率[2],也能提高兼併引物的擴增效率。然而這兩種方法都不能完全解決兼併引物自身固有的缺點,其中,次黃嘌呤鹼基由於能和不同鹼基配對,實際上會增加非特異性擴增,而降落PCR對兼併引物PCR的改善很多時候並不明顯。因此,需要一種既高效、又具有特異性的兼併引物PCR擴增方法。
抑制性PCR是一種特殊的PCR,它能利用單引物與待擴增片段的末 端反向重複 序列結合 進行擴增[3]擴增過程中,末端反向重複序列能夠互補配對,形成一種類似鍋柄狀的結構,模板內部的這種配對跟其與引物的配對存在競爭關係,因而會在一定程度上抑制PCR的擴增效率,抑制性作用的強弱受到末端反向重複序列的長度、引物濃度以及退火溫度等因素的影響,其中長末端反向重複序列、低引物濃度和低退火溫度都能增強抑制性PCR的'作用[3].本研究改進兼併引物的設計,將降落PCR與抑制性PCR有機結合起來,以提高兼併引物PCR擴增的特異性和效率。
1材料和方法
1.1微生物基因組DNA抽提
實驗樣品爲溫泉 的 底 泥 樣 品。樣 品 在 液 氮 中 研 磨 後,加 入10倍 體 積 的CTAB DNA抽 提 緩 衝 液(100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA,1.5mol/L NaCl,2% CTAB),然後加入0.1mg/mL的蛋白酶K,55 ℃水浴鍋中溫浴過夜。加入等體積的苯酚氯仿混勻,10 000r/min離心10min,取上清,加入等體積的異丙醇混勻,12 000r/min離心10min沉澱DNA,棄上清,加入70%乙醇清洗,12 000r/min離心5min,棄上清,風乾10min,加去離子水溶解基因組DNA.
1.2利用抑制性PCR作用改善兼併引物擴增的原理
提高兼併引物PCR擴增效率和特異性的方法見圖1.在兼併引物的5‘末端分別加上一段非兼併序列,兩條兼併引物上所加的序列不一定與初始模板DNA配對。在PCR擴增目的基因片段時,加入低濃度的兼併引物,同時加入能與兼併引物中的非兼併區域序列相匹配的引物(藍色或紅色表示)。這樣既能夠抑制兼併引物的非特異性擴增,使非兼併引物在兩輪PCR循環後就能正常發揮作用,同時也能夠提高PCR擴增效率。此外,由於擴增過程中降低了兼併引物的濃度,能夠有效降低非特異性擴增。在這種情況下,即使存在非特異性的單引物擴增,本方法由於引物增長,導致末端反向重複序列增長,使抑制性PCR作用增強,也能夠達到抑制非特異性產物擴增的作用[3].抑制性PCR的這些特性,可以與降落PCR的最後低退火溫度相結合。
1.3引物設計及PCR
根據GenBank數據庫裏其它聚酮類合成酶(Polyketide synthase,PKS)基因片段的序列比對(圖2),選擇序列保守區,設計帶有5’端接頭的兼併引物PKSF和PKSR,及接頭引物T3P和SP6P.設計的引物序列 如 下:PKSF (5'-GAATTAACCCTCACTAAAGGGARGCNBHNCARHTNGAYCCNCARCA-3‘),PKSR(5'-GGATTTAGGTGACACTATAGATNCCNGTNCCRTGNVYYTC-3’),T3P(5'-GAATTA-ACCCTCACTAAAGGG-3‘),SP6P(5'-GGATTTAGGTGACACTATAGA-3’)。在終體積25μL的PCR反應液中加入10μmol/L的引物PKSF和PKSR各0.1μL,再加入1mol/L的引物T3P和SP6P各0.5μL,PCR反應液的其它成分與普通PCR相似。PCR程序如下:首先94℃預變性2min;隨後15循環的94 ℃ 30s,65℃30s(-1℃/循環),72℃30s;然後30循環的94℃3s,50℃30s,72℃30s;最後72℃延伸10min.
2結果
2.1擴增PKS基因片段
結合降落PCR與抑制性PCR,本研究利用改變設計的引物擴增了溫泉底泥樣品微生物的PKS基因片段,PCR擴增後的產物經電泳檢測,含有目的片段(圖3箭頭所示,泳道1和2爲兩次獨立PCR)。目的片段經切膠回收後,克隆到pUCm-T載體(Sangon Biotech)。隨機挑選兩個用於測序。
2.2獲得PKS基因片段序列分析
兩個克隆獲得的核酸序列及翻譯的氨基酸如圖4所示。兩個克隆除了其兼併引物區序列不一致外,其餘序列相同,證明爲同一物種來源的基因片 段。將 除 兼 並 引 物 區 域 的 核 酸 翻 譯 成 氨 基 酸 序 列 後,利 用BLASTP與GenBank上的蛋白質序列數據庫進行比對,發現其與Gen-Bank上序列號爲gb|AAO39790.1|的序列相似度最高,爲77%.該序列是一種未知微生物的PKS基因片段,證明本研究獲得了新的PKS基因片段。
3討論
爲了提高兼併引物的擴增效率和特異性,本研究改進了兼併引物的設計方法,延長了兼併引物,使其5‘增加了一段接頭序列,利用該接頭序列相匹配的引物,可以提高原有兼併引物擴增的效率。同時也由於引入了這段接頭序列,使PCR可以在引物濃度較低的條件下進行,提高了PCR擴增的特異性,另一方面,對於產生的非特異性的單引物擴增,則有較強的抑制性PCR作用,降低了非特異性產物的擴增效率。利用該方法,本研究擴增獲得了一種新的PKS基因的片段,證明該方法能夠實現相似基因的高效擴增。
參考文獻:
[1]Knoth K,Roberds S,Poteet C,et ly degenerate,inosine-containing primers specifically amplify rare cDNA using the polymerasechain reaction[J]eic Acids Research,1988,16(22):10932.
[2]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.'Touchdown'PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J]eicAcids Research,1991,19(14):4008.
[3]Dai Z M,Zhu X J,Chen Q,et -suppression effect:kinetic analysis and application to representative or long-molecule biasedPCR-based amplification of complex samples[J]nal of Biotechnology,2007,128(3):435-443.
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