過氧化氫酶米氏常數的測定

一、 實驗目的

1. 瞭解米氏常數的測定方法

2. 學習提取生物組織中的酶

二、 實驗原理

1. 米氏反應動力學

米氏方程

(Michaelis-Menten Equation):

2. 米氏常數的意義：

① 反映酶的種類：Km是一種酶的特徵常數，只與酶的種類有關，與酶濃度、

底物濃度無關，過氧化氫酶米氏常數。

② 米氏常數是酶促反應達到最大反應速度Vmax一半時的底物濃度。其數值大

小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之Km值越小，親和能力越強。

③ Km可用來判斷酶（多功能酶）的最適底物：Km值最小的酶促反應對應底物

就是該酶的最適底物。

3.米氏常數的求法：

該作圖法應用最廣。但在低濃度是v值誤差較大，在等差值實驗時作圖點較

集中於縱軸。因此在設計底物濃度時，最好將1/配成等差數列，這樣可使點距較爲平均，再配以最小二乘迴歸法，就可以得到較爲準確的結果。

此法優點是橫軸上點分佈均勻，缺點是1/v會放大誤差，同時對底物濃度的選擇有要求。<>Km時直線將在原點附近與軸相交。

4.氧化酶：生物體內重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內自由基： ①POD：過氧化物酶

②SOD:超氧化物歧化酶

③CAT：；過氧化氫酶

5.過氧化氫酶的作用：

植物體內活性氧代謝加強而使過氧化氫發生積累。過氧化氫可進行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學性質最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細胞內核酸、蛋白質等生物大分子，並且有非常高的速度常數，破壞性極強，可使細胞膜遭受損害，加速細胞的衰老和解體。過氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除過氧化氫、分解氫氧自由基，保護機體細胞穩定的內環境及細胞的正常生活，因此CAT是植物體內重要的酶促防禦系統之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關。

6.過氧化氫酶活力的測定方法：

①紫外吸收法：

過氧化氫在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度（A240nm）隨反應時間而降低。根據測量吸光度的.變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。（以一分鐘內A240nm下降0.1爲一個單位）

②滴定法（高錳酸鉀法、碘量法）

在反應系統中加入一定量（反應過量）的過氧化氫溶液，經酶促反應後，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多餘的過氧化氫。根據單位時間內消耗的過氧化氫的量即可測出過氧化氫酶活力大小。

7.實驗中的反應 ：

H2O2被過氧化氫酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性環境中滴定, 根據反應前後的濃度差可以算出反應速度:

酶

2H2O2 ?→ 2H2O + O2

2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2

（本實驗以馬鈴薯提供過氧化氫酶）

三、 實驗試劑

1. 0.02mol/L 磷酸緩衝溶液 (pH=7.0): 實驗室提供.

2. 酶液: 稱取馬鈴薯 5g, 加緩衝液 10mL, 勻漿過濾.

3. 0.01mol/L 高錳酸鉀.

4. 0.098mol/L H2O2.

5. 25%H2SO4.

四、 實驗操作

取 6 只錐形瓶, 按下表的順序加入試劑.

先加好過氧化氫和蒸餾水, 加酶液後立即混合, 依次記錄各瓶的起始反應時間. 反映到達 5min 立即加入2ml 25%硫酸終止反應, 充分混勻.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩餘的過氧化氫至微紅色, 記錄消耗的高錳酸鉀體積.。

五、注意事項：

1.反應時間必須準確。

2.酶濃度須均一，若酶活力過大，應適當稀釋。

3.滴定終點的判定。

六、實驗結果：

過氧化氫濃度：0.098mol/L

稱取馬鈴薯的質量：5.00g

米氏常數Km= -0.1913

七、實驗結果分析：

1.曲線上少一個點的原因：

用移液管移取序號爲2的過氧化氫溶液（應爲1.25ml）錯誤的移取了1.75ml，故在製圖時將其捨去。

2.曲線線性較好（R2=0.9988）的原因：

本實驗採取了兩人分工的方法完成實驗，控制反應結束及滴定分別由一人完成，所以標準都相同，從而在一定程度上提高了實驗的準確性。

3. Km計算結果呈負值的原因：

Km呈負值（即整條直線都向下移動），亦即所有測定的v值都偏大。

由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推斷最可能的原因是V2整體測量偏小，可能的操作失誤是編號爲0的空白對照組中高錳酸鉀的滴加量偏高，從而使除去該點的整體的高錳酸鉀量都偏小。